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Western Blot 实验解决方案一

添加时间: 2018-12-14 作者: 爱必信 浏览次数: 354
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免疫印迹法 (Western blotting) 是利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术来检测特定样品或提取物中某种特定蛋白的方法,被广泛应用于特定组织/细胞中目标蛋白是否出现及其变量、位移等分析,现在仍然是实验室最常用的蛋白分析平台。

对于实验小白来说,开始学习做 Western 是一个漫长的纠错过程,爱必信 (Absin) 为您分享 WB 整体解决方案,推荐优质的产品,避免试错少走弯路,祝广大的科研朋友早出结果成功发表文章!

样品制备


蛋白样品制备是WB的第一步,是决定结果成败的关键步骤,我们检测的目标蛋白需使用裂解液从组织或细胞中释放,理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml。样品制备的过程需始终在低温下进行,样品提取物应分装保存,可于 -80 ℃ 长期保存,避免反复冻融,我们始终推荐样品要新鲜制备

1. 裂解缓冲液

样品主要分为组织和细胞两类,经过裂解释放的可溶性蛋白能够穿过分离胶单独移动。不同的裂解缓冲液对于蛋白的溶解能力和保存蛋白的状态不同,比如有些蛋白必须保存其天然状态才可被识别,此时应选择不含离子去污剂 (SDS) 或者少含非离子去污剂 (Triton X-100) 相对温和的缓冲液。

裂解液选择指南(直接点击编号可查看产品详情)

   蛋白定位    产品名称    裂解强度    产品编号
   全细胞/膜/核/线粒体    RIPA (中)    中   abs9228
   全细胞/膜/核/线粒体    RIPA (强)    强    abs9229
   全细胞    RIPA (弱)    温和    abs9230
   全细胞/膜/核/线粒体    RIPA (强,无抑制剂)    强    abs9231
   全细胞/膜    NP-40    温和    abs9160
   细胞质(可溶性的)    Tris-HCL    温和    多种产品
   全细胞/膜/核    SDS    强    abs9117
   全细胞/膜/核    WB/IP 细胞裂解液    温和    abs9116
   WB/IP 细胞裂解液  (无抑制剂)    温和    abs9239
   去除红细胞    红细胞裂解液    温和    abs9101

注:普通的WB实验,推荐使用WB/IP细胞裂解液(abs9116。对于某些难溶解蛋白,如果发现WB/IP 细胞裂解液(abs9116)效果不是非常理想,可以尝试使用裂解强度更高的裂解液,例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。

2. 蛋白酶磷酸酶抑制剂

组织或细胞提取物中含有许多内源性的蛋白酶、磷酸酶等,容易导致蛋白降解或去修饰,会影响后续的蛋白检测。因此在裂解缓冲液中添加适当的蛋白酶、磷酸酶等抑制剂是防止蛋白降解和去修饰的有效方法。

常见抑制剂选择指南(直接点击编号可查看产品详情)

   抑制剂    靶蛋白    产品编号    最终浓度
   PMSF    丝氨酸蛋白酶    abs812852    1 mM
   Leupeptin
   亮肽素
   溶酶体    abs45150777    1-10 ug/ml
   Aprotinin
   抑肽酶
   胰蛋白酶、糜蛋白酶、血纤维蛋白溶酶    abs816442    2 ug/ml
   Peptatin
   胃蛋白酶抑制剂A
   Asp 蛋白酶    abs817902    1 ug/ml
   EDTA    镁和锰金属蛋白酶    abs9133    1-5 mM
   EGTA    钙金属蛋白酶    abs42017684    1 mM
   原钒酸盐    酪氨酸磷酸酶    abs817431    1 mM
   β-甘油磷酸盐    丝氨酸和苏氨酸磷酸酶    abs47014865    1-2 mM
   广谱型蛋白酶抑制剂混合物      abs9161    与样品比例:1:100
   广谱型磷酸酶抑制剂混合物      abs9162    与样品比例:1:100

 注:推荐选择商品化的蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物,本品经配方优化,可以稳定、有效、全面抑制常规细胞或组织样品中的各种蛋白酶/磷酸酶活性,并且成分公开便于评估抑制效果及后续实验影响。

3. 蛋白浓度测定

用Bradford、Lowry或BCA方法测定蛋白质含量,牛血清白蛋白(abs9155)是常用的蛋白标准。一旦确定了每管的蛋白浓度就可以在-20℃或-80℃冷冻样品备用。

提醒:此步骤一定不要忘记,蛋白定量是为了保证结果的可靠性,如果不定量,泳道的加样量相同,有可能跑出来的条带一粗一细,无法根据一粗一细的条带来判断是否粗的样品蛋白表达水平高于细的。如果内参条带均匀则可以解决这个问题,但是不定量蛋白想得到均匀的内参条带也是个碰运气的活儿。

上样与电泳


 1. 凝胶条件和上样缓冲液

抗体特异性识别目标蛋白的部位可能存在于蛋白的三维构型内部,须将蛋白的三维构型打开,即使蛋白变性,使用含有SDS的上样缓冲液,通过加入还原剂β巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT,cat. abs9226),减少二硫键的形成,使蛋白变成一个松散的结构。有些抗体识别的抗原表位在蛋白的天然结构中由非临近氨基酸组成,只能辨认折叠结构表面上的抗原,须在非变性条件下进行WB,要求样品及电泳缓冲液中不能含有SDS,也不能加热样品。有些抗体仅识别非还原形式的蛋白,如氧化形式的蛋白,要求上样及电泳缓冲液中不能含有β巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)。

   蛋白状态    凝胶条件    上样缓冲液    电泳缓冲液
   还原-变性    还原&不变性    β巯基乙醇或DTT和SDS    有SDS
   还原-天然    还原&不变性    β巯基乙醇或DTT无SDS    无SDS
   氧化-变性    非还原&变性    无β巯基乙醇或DTT,有SDS    有SDS
   氧化-天然    非还原&天然    无β巯基乙醇或DTT,无SDS    无SDS

注:一般抗体产品说明中没有指明,就需要进行还原和变性。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)为网状结构,具有分子筛效应,可根据蛋白质分子量大小分离蛋白质。检测非变性(天然)蛋白,选用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE);检测变性蛋白选用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)。可根据蛋白质分子量大小,选择合适的凝胶浓度,以达到蛋白质迁移率和分离度最优的结果。

分子量  凝胶浓度
4-40 KDa 20%
12-45 KDa 15%
10-70 KDa 12.50%
15-100 KDa 10%
25-200 KDa 8%


上样缓冲液选择指南
(直接点击编号可查看产品详情)

   产品    货号
   2X Laemmli样品缓冲液    abs9237
   10%SDS十二烷基硫酸钠溶液    abs9238
   2*上样缓冲液 (适用于SDS-PAGE)    abs953


预制胶选择指南
(直接点击编号可查看产品详情)

   产品    货号
   预制胶 10%,10 wells    abs9301
   预制胶 10%,15 wells    abs9308
   预制胶 12%,10 wells    abs9302
   预制胶 12%,15 wells    abs9309
   预制胶 15% ,10 wells    abs9303
   预制胶 15% ,15 wells    abs9310
   预制胶 4-15%, 10 wells    abs9304
 
   产品    货号
   预制胶 4-15%, 15 wells    abs9311
   预制胶 4-20%, 10 wells    abs9305
   预制胶 4-20%, 15 wells    abs9312
   预制胶 8%, 15 wells    abs9307
   预制胶 8-20%, 10 wells    abs9306
   预制胶 8-20%, 15 wells    abs9313
   ...

注:默认产品为SDS-PAGE,如果需要检测天然蛋白,可以备注,我们会赠送Native粉末。

将凝胶浸泡在足够的电泳缓冲液 (又叫 running buffer, abs951 或选择蛋白电泳套装: abs925)中,开始准备上样。使用特定的凝胶上样吸头或微型注射器在泳道(样品池)中缓慢加入全部样品,注意不要用尖头刺破底部,否则会形成扭曲的条带,也不要过量加样使样品溢入旁边的泳道(上样总体积一般不超过 15 ul)。我们推荐上样样品蛋白总量不低于 20 ug,一般 20 ug - 40 ug。注意:加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也有可能使样品溢出;加入下一个样品时,进样器要在外槽电泳缓冲液中洗涤数次,以免交叉污染。

2. marker的选择

我们常说的跑电泳,可以用下图来形象描述蛋白质在凝胶中的运动:

为了分析和区分未知蛋白组的分子量大小,需要设置一个特殊的有指示性的跑道,即蛋白marker(蛋白分子量标准)组,只有标准量精确无误,实验的结果才具有说服力。

目前实验室最常用的是彩虹预染marker,测定蛋白分子量的大小的同时还可以监测蛋白的迁移进程、评估转印效率,不必再用考马斯亮蓝凝胶染色,也不需要丽春红染色观察,彩虹预染marker已是实验室必备试剂。

预染marker选择指南

   产品名称    货号    规格
   预染蛋白marker, 10-245 KDa    abs923    500 ul, 5*500 ul
   预染蛋白marker, 10-180 kDa    abs924    250 ul, 2*250 ul

爱必信 (absin) 预染marker图示

3. 内参的选择

WB实验的内参是必须要设置的,它可以检测凝胶中泳道的上样量是否相同,通过内参的表达量对每个样品目的蛋白进行校正后,不同样品之间再进行目的蛋白的表达比较,同时内参蛋白还可作为实验阳性对照,考察实验过程及体系是否正常。

内参选择指南

   内参    样品类型    分子量    产品编号
   Beta-actin    全细胞/细胞质    43 KDa    abs830031
   GAPDH    全细胞/细胞质    30-40 KDa    abs830030
   Tubulin    全细胞/细胞质    55 KDa    abs830032
   VCDA1/Porin    线粒体    31 KDa  
   COXIV    线粒体    16 KDa    abs131570
   Lamin B1    细胞核 (不适于去除核膜的样本)    16 KDa    abs132556
   TBP    细胞核    38 KDa    abs131578
 
4. 电泳
电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80 – 100 V,高电压可以设置在120 V左右。为了电泳方便起见,也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式,通常把电压设置在100 V,然后设定定时时间为90 - 120 min。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
 

转膜


凝胶电泳之后,我们需要将位于凝胶上的电泳条带转移到硝化纤维素膜 (NC膜) 或PVDF膜上,不同的膜对于蛋白的吸附能力、溶剂的抗性等都有所不同,导致实验结果中灵敏度、背景等都会受到影响。我们首先推荐使用PVDF膜,根据目的蛋白的大小,小于20KD的蛋白选择0.2 PVDF膜和大于20KD的蛋白选择0.45 PVDF膜。根据实验室的传统和习惯,也可以使用NC膜,但是NC膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开,需要注意。

转印膜选择指南
   编号    产品    规格
   abs931    膜0.2 μm    20张
   abs932    PVDF膜0.45 μm    张
   abs959    NC膜0.2 μm    20张
   abs960    NC膜0.45 μm    20张

经典的转膜方式分为半干转和湿转两种,我们推荐的最佳转移方法是湿转,即把滤纸-凝胶-膜-滤纸“三明治”完全浸入缓冲液中,转膜成功率高,时间和电压可以优化 (可参考:湿转,在浸没的情况下通过电泳转移至0.2 μm 孔径的NC膜,在冷却的含20%甲醇的转移缓冲液中转膜,70V,1.5h )

 

半干转是指将浸满缓冲液的滤纸-凝胶-膜-滤纸“三明治”系统,置于本应干燥的阳极和阴级板上,转移在桌面进行,在室温下约15-60 min,转移低分子量和高分子量时这一系统运转良好,相比湿转所需的缓冲液更少,但是在某些情况下会产生更高的背景。

   编号    产品名称    规格
   abs950    10*电转液    100ml, 1L

封闭


有两种传统封闭液:脱脂奶粉(abs9174) 或BSA (abs9155),脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白(因脱脂奶粉含有酪蛋白,该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白,会结合磷酸化特异性抗体而产生高背景)。


我们建议参考以下方案进行封闭:

转膜之后迅速在Tris-Buffered Saline (TBS) 中洗涤膜,以便移除残留的转移缓冲液,随后在室温条件下含5% 脱脂奶粉的TBS 和Tween 20 去污剂 (TBST) 中封闭1h。这种封闭步骤有助于降低非特异性一抗结合并降低背景。避免封闭时间过长,会掩盖掉抗原表位,组织抗体结合。封闭后在TBST中洗涤5min。

-------------------------未完待续

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