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免疫(共)沉淀CoIP - workflow

添加时间: 2019-01-11 作者: 爱必信 浏览次数: 463
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简介

免疫(共)沉淀(IP/CoIP)是基于抗体和蛋白的特异性亲和作用,通过捕获与蛋白或抗原特异性结合的抗体,进而从复杂的样品中捕获及富集目标蛋白,同时可以测定与之相互作用的蛋白或其它生物大分子。
为了获得更好的实验结果,所有的步骤均需根据实际情况进行优化。
例如:根据细胞系或被捕获的抗原后续用途的不同,可选择更加合适的细胞裂解条件。对于没有细胞壁结构的哺乳动物细胞,可以直接使用去污剂进行裂解,其它细胞则需要一些机械剪切力辅助,例如超声破碎。
另外,细胞裂解物在进行免疫(共)沉淀前,可先进行蛋白免疫印迹法检测,以此来确定细胞裂解物里存在目标蛋白。

操作步骤

A. 制备细胞裂解物
1. 吸干培养基。添加含有调节分子的新鲜培养基,使其在预定的时间内对细胞进行处理。
2. 收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 1X PBS (abs962abs961)洗涤细胞一次。
3. 去除 PBS 并在每个细胞板上 (10 cm) 加入 0.5 ml 冰预冷的 Lysis buffer(abs955组分,或abs9116abs9239),并在冰上孵育至少 5分钟。
注: Lysis buffer 使用前,立刻加入 1 mM PMSF(abs9146)。
4. 从板上刮下细胞,把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5. 在冰上进行 3 次超声破碎,每次 5 秒。
6. 在 4°C,在 14000 x g 条件下,微量离心 10 分钟,将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要,裂解物可保存在-80°C。
注:细胞裂解物制备好之后,可先进行蛋白免疫印迹法检测,以此来确定细胞裂解物里存在目标蛋白(abs926abs927abs928WB solution base kit)。

B. 免疫沉淀法
细胞裂解物预清除(可选步骤)
1. 向500μl(含总蛋白200-1000ug)细胞裂解物中添加 5μl Protein A 和 5μl Protein G(abs955组分)。
2. 在4°C下,旋转孵育30-60分钟。
3. 在4°C条件下12000g离心1min,保留上清,待用。
抗原抗体结合
1. 在新的离心管内加入500μl(含总蛋白200-1000ug)细胞裂解物(可以是预清除后的细胞裂解物)。
2. 加入目标蛋白的单克隆/多克隆抗体(1-5μg)(IP一抗),
3. 同时采用非特异性免疫的同源抗体normal IgG作为对照(abs20035abs20038)。
4. 在 4℃轻柔混合过夜。
免疫复合物沉淀
1. 抗体孵育过夜后,加入5μl Protein A和5μl Protein G(abs955组分)。
2. 在4℃温和地混匀1-3小时或过夜。
3. 12000g离心1min,保留沉淀。
4. 使用0.5ml 1*Wash buffer(abs955组分)清洗沉淀,12000g离心1min,保留沉淀。
5. 重复第4步,共计清洗3次。
注:清洗,去上清的时候需要注意避免吸走填料

C. 用蛋白免疫印迹法进行分析
1. 在 20-40 µl 1* SDS样品缓冲液(abs955组分,或abs953)中重悬沉淀物。涡旋振荡,然后再微量离心30秒。
2. 将样品加热至 95–100°C并持续2-5分钟,然后在14,000 x g下瞬时离心 1 分钟。
3. 将样品 (15-30 µl) 上样到 SDS-PAGE (预制胶abs9300-abs9313)凝胶上。
4. 用蛋白质印迹法分析样品(WB一抗、二抗;abs926abs927abs928,WB solution base kit)。
注:对于分子量接近50kDa的蛋白,我们建议使用特异性识别轻链的二抗,以将变性重链产生的遮盖作用减到最小;对于分子量接近 25 kDa 的蛋白,则建议使用特异性识别重链的二抗(推荐Jackson或其他)。

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